酶底物法測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌質量控制研究
１引言
總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌是人和溫血動物腸道中的正常寄生細菌，是水體糞便污染的指示菌，也是水質評價的重要微生物指標之一。總大腸菌群是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，包括埃希氏菌屬、腸桿菌屬、檸檬酸菌屬、克雷伯菌屬等菌屬。糞大腸菌群又叫耐熱大腸菌群，是總大腸菌群中的一部分，主要包括埃希氏菌屬和耐熱克雷伯菌屬，其能夠更為貼切反映水體受糞便污染程度。大腸埃希氏菌又稱大腸桿菌，是總大腸菌群、糞大腸菌群的主要種類。總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌常用的測定方法主要有多管發酵法、濾膜法、紙片法和酶底物法。酶底物法由于具有檢出限低、準確度高、操作方便、時效性高等優點，從而得到了廣泛應用。但目前對酶底物法測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的質量控制研究仍較少，本文將從實驗部分、實驗室要求、實驗室人員、工作菌懸液、設備、標準陽性比色盤和廢棄物處理等方面對實驗室質量控制進行研究，為檢測結果的準確性提供保障，能夠更好地服務環境保護工作。
２實驗部分
２．１試劑和材料
培養基；硫代硫酸鈉溶液：０．１０ｇ／ｍＬ；乙二胺四乙酸二鈉溶液：０．１５ｇ／ｍＬ；９７孔定量盤；標準陽性比色盤。
２．２儀器和設備
高壓蒸汽滅菌器：１２１℃可調；恒溫培養箱：允許溫
度偏差３７℃±１℃、４４．５℃±０．５℃；程控定量封口
機；紫外燈：波長３６５～３６６ｎｍ。
２．３標準菌株
（１）金黃色葡萄球菌：２６００３－５ａ２８－２（Ｆ２），中國藥品食品檢定研究院。
（２）產氣腸桿菌：ＣＩＣＣ１０２９３（Ｆ２），中國工業微生物
菌種保藏管理中心。
（３）大腸埃希氏菌：４４１０２－３ａ２３－３（Ｆ２），中國藥品食品檢定研究院。
２．４樣品測定方法
根據《水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法》（ＨＪ１００１－２０１８）進行樣品采集、保存、接種、培養以及結果判讀、結果計算。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于３７℃±１℃下培養２４ｈ，糞大腸菌群于４４．５℃±０．５℃下培養２４ｈ。每次實驗應填寫恒溫培養箱溫控記錄。
２．５實驗室空白
每批樣品都要用無菌水進行實驗室空白測定。量取１００ｍＬ無菌水于滅菌后的三角瓶，加入２．７ｇ±０．５ｇ培養基粉末，充分混勻，完全溶解后全部倒入９７孔定量盤內，趕除氣泡，
程控定量封口機封口。總大腸菌群、大腸埃希氏菌于３７℃±１℃下培養２４ｈ，糞大腸菌群于４４．５℃±０．５℃下培養２４ｈ。２．６陰性和陽性對照將標準儲存菌株制成３００～３０００個／ｍＬ的工作菌懸液，取１００ｍＬ菌懸液于滅菌后的三角瓶中，加入２．７ｇ±０．５ｇ培養基粉末，充分混勻至完全溶解后，全部倒入９７孔定量盤內，以手撫平９７孔定量盤背面，趕除孔內氣泡，然后用
程控定量封口機封口。將封口后的９７孔定量盤放入特定溫度的恒溫培養箱中培養２４ｈ。
２．７精密度測定
對低、中和高３種濃度的實際水樣進行測定，每個樣品平行測定６次，以驗證方法精密度。
２．８準確度測定
對有證標準樣品進行測定，以驗證方法準確度。
３質量控制
３．１實驗室要求
實驗室空間安排要合理，需要配備：①準備室：進行培養基制備，需明確標示出無菌區和非無菌區；②無菌室：放置超凈工作臺，以用于接種水樣；③培養室：主要放置用于培養微生物的恒溫培養箱；④鑒定室：放置生物安全柜，用于轉移培養微生物；⑤高溫室：主要用于對廢棄物和其他器具進行高溫消毒。無菌室在使用前后都要進行清潔消毒處理，并每月對無菌室進行沉降菌測試。實驗室要求通風良好、避免灰塵、溫度恒定，室內墻壁和地板要使用防透水材料，工作臺應使用光滑、防水、抗腐蝕、接縫少的材料，保持室內空氣的清潔和實驗室用具的整潔。
３．２實驗室人員
實驗員應具有一定的專業理論知識和技能，并獲得專業考試證書；應積極參加培訓和理論知識學習，不斷提高業務技術水平并及時掌握微生物檢測新技術；定期進行方法比對及人員比對；應具有嚴謹認真的工作態度。
３．３工作菌懸液制備
標準菌株需要從標準菌種保藏中心或其他有效認證的商業機構獲得，嚴格按照使用說明書進行復蘇，并按照《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養基和試劑的質量要求》（ＧＢ４７８９．２８－２０１３）制備成標準儲存菌株，于－２０℃低溫冷藏箱中保存。自－２０℃低溫冷藏箱取出標準儲存菌株一支，將菌液全部倒入盛有５０ｍＬ適合的液體培養基中，于３６．５℃、３０ｒ／ｍｉｎ水浴恒溫振蕩器中培養１８ｈ。然后驗證菌株的純度和形態，挑取２～３個典型菌落于３６．５℃、３０ｒ／ｍｉｎ水浴恒溫振蕩器中培養１８ｈ。將培養后的菌懸液進行稀釋，以血球計數板初步計數每小格２～３個活動菌為宜，計算出菌液濃度，再根據菌液濃度稀釋至３００～３０００個／ｍＬ。
３．４設備
培養總大腸菌群、大腸埃希氏菌所用恒溫培養箱應達到３７℃±１℃，培養糞大腸菌群所用的培養箱應達到４４．５℃±０．５℃，每天都要檢查培養箱溫度是否穩定無誤，填寫控溫使用記錄。高壓蒸汽滅菌器每次使用時應用１２１℃壓力蒸汽滅菌化學指示卡檢查是否符合滅菌條件，每季度進行一次嗜熱脂肪肝菌芽孢菌片滅菌效果評價。計量部門對上述設備每年校準一次，檢查溫度是否達到要求。實驗人員根據校準證書中的溫度偏差進行修正，并在設備正面標明修正因子。紫外線燈需定期檢測，包括對紫外線波長、強度及評價其消毒效果的物理學指標和生物學指標的檢測。
３．５標準陽性比色盤
標準陽性比色盤應置于干燥陰涼處避光存放，孔內的液體不少于其體積的２／３，否則需要重新更換。隨時觀察比色盤以防比色盤內液體顏色發生變化，影響數據準確性。無特殊情況需按其有效期提前更換。
３．６廢棄物處理
實驗過程產生的具有潛在危險的廢棄物，需要進行高壓蒸汽滅菌，在確保微生物滅活后，液體廢棄物倒入下水道，菌株培養的廢棄物應放入標有生物危害的黃色塑料袋中，交由有資質的單位處理。對于實驗室產生的其他一般廢棄物，將其放入一般垃圾袋中即可。
４結果討論
４．１空白對照
培養后９７孔定量盤均無任何顏色變化，證明實驗室空白合格。
４．２陰性和陽性對照
將各標準菌株制成３００～３０００個／ｍＬ的菌懸液，將菌懸液按方法要求接種培養，結果顯示陽性菌株呈現定量盤顏色變為黃色為陽性反應，陰性菌株呈現定量盤顏色不發生變化為陰性反應，證明陰陽性對照試驗合格。
４．３精密度
將低、中和高３種不同濃度樣品分別對總大腸菌群、大腸埃希氏菌和糞大腸菌群進行平行測定６次，結果見表１～３。結果顯示，低、中和高濃度樣品中總大腸菌群測定的相對標準偏差分別為１．２％、１．０％和１．９％，糞大腸菌群測定的相對標準偏差分別為１．７％、２．７％和５．９％，大腸埃希氏菌測定的相對標準偏差分別為１．７％、１．４％和７．２％，均滿足要求。
４．４準確度
總大腸菌群標準樣品ＱＣ－ＦＤ－０３５標準值為５２００（２３００～１２０００）ＭＰＮ／１００ｍＬ，測定值為４２７９ＭＰＮ／１００ｍＬ；糞大腸菌群標準樣品ＱＣ－ＦＤ－００６標準值為１３０００ＭＰＮ／ｍＬ，測定值為１２４３９ＭＰＮ／ｍＬ；腸埃希氏標準樣品ＱＣ－ＦＤ－０３３標準值為３１００（１０００～９５００）ＭＰＮ／１００ｍＬ，測定值為２００１ＭＰＮ／１００ｍＬ，均滿足要求。
表１ 總大腸菌群的測定結果
表２ 糞大腸菌群的測定結果
表３ 大腸埃希氏菌的測定結果
綜上所述，采用酶底物法檢測水中的總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌，對樣品進行全程序空白對照，陰陽性對照試驗，以及對準確度進行驗證，結果都在質量控制范圍內。按照以上質量控制要求，加強管理，可獲得 數 據，滿足方法要求。酶底物法具有簡便、精準、快速、方法檢出限低等優點，使 酶 底 物 法測定總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的應用越來越廣泛，所以，做好酶底物法測定水中總大腸的質量控制研究具有非常重要的意義。
