DB61/T1138-2018陜西省地方標準水質糞大腸菌群的測定酶底物法
1范圍
本標準規定了水中糞大腸菌群測定的酶底物法的術語和定義、方法原理、試劑與原料、儀器與設備、 樣品、分析步驟、結果計算與表示、質量控制、廢物處理的要求。
本標準適用于地表水、生活污水和廢水中糞大腸菌群的測定。
當接種量為300mL時，方法的檢出限為3MPN/L,檢測范圍為3MPN/L~230MPN/L；當接種量為100mL時，方 法的檢出限為10MPN/L，采用51孔定量孔板的檢測范圍為10MPN/L-2005MPN/L，采用97孔定量孔板的檢 測范圍為10MPN/L-24196MPN/L。
2規范性引用文件
下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件 。凡是不注日期的引用文件，其新版本適用于本文件。
GB/T 5750.12生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標
GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法
3術語和定義
下列術語和定義適用于文件
3.1
糞大腸菌群 fecal coliforms
糞大腸菌群，又稱耐熱大腸菌群（thermotolerant coliforms）。是一種通常在44.5℃培養發酵乳糖 產酸產氣、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
3.2
可能數基于泊松分布的一種簡介計數方法。
4方法原理
糞大腸菌群在鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖（ONPG）培養基上培養產生β-D-半乳糖苷酶（β-D- galactosidase）,該酶可以分解色源底物釋放出黃色的鄰硝基苯酚，通過顏色變化定性，MPN法定量。
5.試劑與材料
5.1除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為符合GB/T6682中規定的水。
5.2培養基選擇市售商品化酶底物法試劑，或自行配置培養基，基本成分參照附錄A。
5.3硫代硫酸鈉（NA2S2O3）。
5.4乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-NA2）。
5.5氯化鈉（NACL）。
5.6硫代硫酸鈉溶液：ρ（NA2S2O3）=0.10g/ml。
注：稱取硫代硫酸鈉（5.2）10g，適量水溶解，定容至100ml，臨用現配。
5.7乙二胺四乙酸二鈉（5.3）15g,適量水溶解，定容至100ml，搖勻，常溫下可存放30d。
5.8滅菌生理鹽水：ρ（NaCl）=0.9%(m/v)。
注：稱取氯化鈉（5.4）0.9g，適量水溶解，定容至100mL，經121℃高壓蒸汽滅菌20min,備用。
6 儀器與設備
6.1采樣瓶：500mL棕色磨口玻璃瓶。
6.2恒溫培養箱：44.5℃±0.5℃。
6.3高壓蒸汽滅菌器：121℃、0.101Mpa。
6.4冰箱：0℃~4℃。
6.5恒溫干燥箱：0℃~300℃。
6.6
程控定量封口機：帶51孔和97孔膠托。
6.751孔和97孔定量孔板：無菌。
6.8100mL無菌取樣瓶。
6.9試管： 15mm×150mm,帶透氣膠塞。
6.10標準陽性比色盤。
6.11移液管：1mL、10mL，也可采用體積可調式移液器。
6.12錐形瓶：500mL。
6.13量筒：100ml。
6.14移液管、試管、量筒、采樣瓶等均需包扎經121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。
7樣品
7.1樣品采集
7.1.1與其他項目一同采樣時，先單獨采集微生物樣品。采樣瓶（6.1）不得用水樣洗滌，按照無菌操作的要求采集水樣于滅菌的采樣瓶中。
7.12采集江、河、湖、庫等地表水時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，距水面約 10cm~15cm處，可握住瓶子水平前推。采樣后瓶內要留足夠的空間，一般采樣量為采樣瓶容量的80%左 右。采好水樣后，迅速蓋好瓶蓋并扎上無菌包裝紙。
7.13從龍頭裝置采集樣品時，要選用完好無損的龍頭，采水前將龍頭打開至大，防水3min~5min；然 后將龍頭關閉，用火焰灼燒3min滅菌，開足龍頭，再放水1min.采樣時控制水流速度。
7.14采集地表水、廢水樣品及一定深度的水樣時，可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點 進行分層采樣時，應自上而下進行。
7.2樣品保持
樣品在10℃一下冷藏運輸，運輸時間不超過6h。實驗室接樣后不能立即展開檢測的，應將樣品放入0℃ ~4℃冰箱（6.4）保存，在2h內檢測。
7.3干擾和消除
酸性樣品，應在分析前按無菌操作要求調節樣品pH值7.0~8.0。在采樣瓶滅菌前加入0.4mL硫代硫酸鈉 溶液（5.5）以出去余氯對細菌的抑制作用；在采樣瓶滅菌前加入1.2mL乙二胺乙酸二鈉溶液（5.6）以 除去重金屬對細菌的抑制作用。
8分析步驟
8.1水樣接種量
水樣充分混勻后，根據水樣污染的程度確定水樣的接種量，水樣的接種量可參考表1。
8.2接種
8.2.1清潔水樣
8.2.1.1接種量為300mL時，接種水樣為2份100mL和10份10mL。
8.2.1.2量取2份100mL時，用無菌取樣瓶（6.8）量取100mL水樣，加入2.7g+_0.5g酶底物法試劑（5.1 ），充分混勻溶解，將溶解液倒入51孔或97孔定量孔板（6.7）中根據水樣污染程度選擇合適的孔板， 排除氣泡后用程控定量封口機（6.6）進行封口。
8.2.2.2接種量＜100mL時，以104為例，取1mL水樣加入100mL無菌取樣瓶中，用滅菌生理鹽水（5.7） 稀釋定容至刻度線，混勻，再取稀釋后的水樣1mL，重復上述操作，一下操作按照8.2.2.1進行。
8.3培養
將8.2.1和8.2.2中接種后的取樣瓶、試管或孔板放入恒溫培養箱中44.5+0.5培養24h+2h。
8.4對照試驗
8.4.1空白試驗
用滅菌生理鹽水代替樣品按照8.2和8.3進行測定。
8.4.2陽性及陰性對照
8.4.2.1糞大腸菌群測定的陽性菌株為大腸埃希氏菌，陰性菌株為產氣腸桿菌。
8.4.2.2標準菌株的菌懸液濃度建議使用0.3麥氏濃度值~0.4麥氏濃度值，取適量后按照8.2.2.2進行接 種，按8.3培養后，大腸埃希氏菌呈現陽性反應，產氣腸桿菌呈現陰性反應。
8.5結果判讀
取樣瓶、試管或孔板經培養后，對照陽性比色盤（6.10），水樣變黃判斷為糞大腸菌群陽性，不變色 判斷為糞大腸菌群陰性。記錄取樣瓶、試管陽性個數，51孔定量孔板（6.7）記錄大孔陽性數，97孔定 量孔板（6.7）分別記錄大孔和小孔陽性數。
9結果計算與表示
9.1結果計算
9.1.1接種量為300ml
根據8.5中取樣瓶和試管陽性個數，查MPN表（附錄B）可得每升水樣中糞大腸菌群MPN數。
9.1.2接種量≤100mL
根據8.5中51孔定量孔板陽性數，查51孔MPN表（附錄C）；根據8.5中97孔定量孔大孔和小孔的陽性數 ，查97孔MPN表（附錄D），再根據樣品的稀釋度，按公式（1）換算為每1L水樣中糞大腸菌群的濃度。
10質量控制
10.1實驗室應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。
10.2每批培養基應按本標準8.4的要求采用有證標準菌株進行陽性、陰性對照試驗（見表2）。
10.3宜選用市售商品化培養基，以減少配制中產生的誤差。
10.4應定期使用有證標準物質/樣品進行質量控制。
10.5每批樣品至少測定10%的平行雙樣，測試結果以算數平均值計算。
表2陽性、陰性對照菌株參考表
菌株名稱 英文名 菌株編號
大腸埃希氏菌 Escherchina coli CICC 24176
產氣腸桿菌 Enterobacter aerogenes CICC 10293 或 ATCC 13048
11廢物處理
使用后的器皿及廢棄物應經121℃高壓蒸汽滅菌30min處理。
