生活飲用水標準檢驗方法微生物指標GBT5750.12-20
菌落總數
1.1平皿計數法
1.1.1范圍
本標準規定了用平皿計數法測定生活飲用水及其水源水中的菌落總數。
本法適用于生活飲用水及其水源水中菌落總數的測定。
1.1.2術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
1.1.2.1菌落總數 standard plate-count bacteria
水樣在營養瓊脂上有氧條件下37℃培養48H后，所得1ml水樣所含菌落的總數。
1.1.3培養基與試劑
1.1.3營養瓊脂
1.1.3.1.1 成分：
A 蛋白胨 10g
B 牛肉膏 3g
C 氯化鈉 5g
D 瓊脂 10g-20g
E 蒸餾水 1000ml
1.1.3.1.2 制法：將上述成分混合后，加熱溶解，調整PH為7.4-7.6，分裝于玻璃容器中（如用含雜質較多的瓊脂時，應縣過濾），經103.43kpa(121℃，15Ib)滅菌20min,儲存于冷暗處備用。
1.1.4 儀器
1.1.4.1 高壓蒸汽滅菌器
1.1.4.2 干熱滅菌箱
1.1.4.3 培養箱36℃±1℃。
1.1.4.4 電爐。
1.1.4.5 天平。
1.1.4.6 冰箱。
1.1.4.7放大鏡或菌落計數器
1.1.4.8PH計或精密PH試紙。
1.1.4.9滅菌試管、平皿（直徑9cm）、刻度吸管、采樣瓶等。
1.1.5檢驗步驟
1.1.5.1生活飲用水
1.1.5.1.1以無菌操作方法用滅菌吸管吸取1ml充分混勻的水樣，注入滅菌平皿中，傾注約15ml已融化并冷卻到45℃左右的營養瓊脂培養基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養基充分混勻。每次檢驗時應做一平行接種，同時另用一個平皿只傾注營養瓊脂培養基作為空白對照。
1.1.5.1.2 待冷卻凝固后，翻轉平皿，使底面向上，置于36℃±1℃培養箱內培養48h，進行菌落計數，即為水樣1ml中的菌落總數。
1.1.5.2 水源水
1.1.5.2.1 以無菌操作方法吸取1ml充分混勻的水樣，注入盛有9mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1:10稀釋液。
1.1.5.2.2吸取1:10稀釋液1mL注入盛有9mL滅菌勝利鹽水中的試管中，混勻成1:100稀釋液。按同法依次稀釋成1:1000,1:10000稀釋液等備用。如此遞增稀釋一次，必須更換一支1ml滅菌吸管。
1.1.5.2.3用滅菌吸管取未稀釋的水樣和2個~3個適宜稀釋度的水樣1ml，分別注入滅菌平皿內。以下操作同生活飲用水的檢驗步驟。
1.1.6菌落計數及報告方法
作平皿菌落計數時，可用眼睛直接觀察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平皿的菌落數后，應求出同稀釋度的平均菌落數，供下一步計算時應用。在求同稀釋度的平均數時，若其中一個平皿有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應無片狀菌落生長的平皿作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，則可將此半皿計數后乘2以代表全皿菌落數。然后再求該稀釋度的平均菌落數。
1.1.7不同稀釋度的選擇及報告方法
1.1.17.1 先選擇平均菌落數在30-300之間者進行計算，若只有一個稀釋度的平均菌落數符合此范圍內，則將該菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中實例 1）
1.1.7.2 若有兩個稀釋度，其生長的菌落數均在30-300之間，則視二者之比值來決定，若其比值小于2應報告兩者的平均數（如表1中實例2）。若大于2則報告其中稀釋度較小的菌落數（如表1中實例3）。若等于2亦報告其中稀釋度較小的菌落數（見表1實例4）。
1.1.7.3 若所有稀釋度的平均菌落數大于300，則應按稀釋度高的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中實例5）。
1.1.7.4 若所有稀釋度的平均菌落數小于30，則應以稀釋度低的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中實例6）。
1.1.7.5 若所有稀釋度的平板上均無菌落生長，則應以接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之（見表1中實例7）
1.1.7.6 若所有稀釋度的平板上均無菌落聲場，則以未檢出報告之。
1.1.17.7 如果所有平板上都菌落密布，不要用“多不可計”報告，而應在稀釋度大的平板上，任意數其中2個平板1cm2中的菌落數，除2求出每平方厘米內平均菌落數，乘以皿底面積63.6cm2,再乘其稀釋倍數做報告。
1.1.7.8菌落技術的報告：菌落數在100以內時按實有數報告，大于100時，采用兩位有效數字，在兩位有效數字后面的數值，以四舍五入方法計算，為了縮短數字后面的零數也可用10的指數來表示（見表1“報告方式”欄）。
表一 稀釋度選擇及菌落總數報告方式
|
實例 |
不同稀釋度的平均菌落數 |
兩個稀釋度菌落數之比 |
菌落總數/（CFU）mL |
報告方式/（CFU）mL |
|
10－1 |
10－2 |
10－3 |
|
1 |
1365 |
164 |
20 |
- |
16400 |
16000或1.6×104 |
|
2 |
2760 |
295 |
46 |
1.6 |
37750 |
38000或3.8×104 |
|
3 |
2890 |
271 |
60 |
2.2 |
27100 |
27000或2.7×104 |
|
4 |
150 |
30 |
8 |
2 |
1500 |
1500或1.5×103 |
|
5 |
多不可計 |
1650 |
513 |
- |
513000 |
510000或5.1×103 |
|
6 |
27 |
11 |
5 |
- |
270 |
270或2.7×102 |
|
7 |
多不可計 |
305 |
12 |
- |
30500 |
31000或3.1×104 |
2.總大腸菌群
2.1多管發酵法
2.1.1范圍
本標準規定了用多管發酵法測定生活飲用水及其水源水中的總大腸菌群。
本法適用于生活飲用水及其水源水中總大腸菌群的測定。
2.1.2術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
2.1.2.1總大腸菌群
總大腸菌群指一群在37℃培養24h能發酵乳糖、產酸產氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。
2.1.3培養基與試劑
2.1.3.1乳糖蛋白胨培養液
2.1.3.1.1成分
A蛋白胨 10g
B牛肉膏 3g
C乳糖 5g
D氯化鈉 5g
E溴甲酚紫乙醇溶液（16g/l）1mL
F蒸餾水 1000mL
2.1.3.1.2
制法
將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調整PH為7.2~·7.4，在加入1mL16g/L的溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，68.95kpa（115℃，10lb）高壓滅菌20min,貯存于冷暗處備用。
2.1.3.3 伊紅美藍培養基
2.1.3.3.1成分
A蛋白胨 10g
B乳糖 10g
C磷酸氫二鉀 2g
D瓊脂 20g-30g
E蒸餾水 1000mL
F伊紅水溶液（20g/L）20mL
G美藍水溶液（5g/L）
2.1.3.3.2制法
將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，校正PH為7.2，加入乳糖，混勻后分裝，以68.95kpa（115℃，10lb）高壓滅菌20min,臨用時加熱融化瓊脂，冷至50℃-55℃，加入伊紅和美藍溶液，混勻，傾注平皿。
2.1.3.4 革蘭氏染色液
2.1.3.4.1 結晶紫染色液
A成分：
a 結晶紫 1g
b 乙醇（95%，體積分數）20mL
c草酸銨水溶液（10g/L）80mL
B制法：將結晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。
注：結晶紫不可用龍膽紫代替，前者是純品，后者不是單一成分，易出現假陽性。結晶紫溶液防治過久會產生沉淀。
不在可用。
2.1.3.4.2革蘭氏碘液
A成分：
a碘 1g
b碘化鉀2g
c蒸餾水 300mL
B制法：將碘和碘化鉀先進行混合，加入蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水。
2.1.3.4.3 脫色劑
乙醇（95%，體積分數）。
2.1.3.4.4沙黃復染液
A成分：
a沙黃 0.25g
b乙醇（95%，體積分數）10mL
C蒸餾水 90mL
B制法：將沙黃溶解于乙醇中，待完全溶解后加入蒸餾水。
2.1.3.4.5 染色法
A將培養18h-24h的培養物涂片。
B將涂片在火焰上固定，滴加結晶紫染色液，染1min，水洗。
C滴加革蘭氏碘液，作用1min，水洗。
D滴加脫色劑，搖動玻片，直至無紫色脫落為止，約30s，水洗。
E滴加復染劑，復染1min，水洗，待干，鏡檢。
2.1.4儀器
2.1.4.1培養箱：36℃±1℃。
2.1.4.2冰箱：0℃~4℃。
2.1.4.3天平。
2.1.4.4顯微鏡。
2.1.4.5平皿：直徑為9cm。
2.1.4.6試管。
2.1.4.7分度吸管：1mL，10mL。
2.1.4.8錐形瓶。
2.1.4.9小倒管。
2.1.4.10載玻片。
2.1.5 檢驗步驟
2.1.5.1.1取10mL雙乳糖蛋白胨培養液中，取1ml水樣接種到10ml單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1ml水樣注入到9mL滅菌生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1mL水樣）注入到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度接種5管。
對已處理過的出廠自來水，需經常檢驗或每天檢驗一次的，可直接5份10mL水樣雙料培養基，每份接種10mL水樣。
2.1.5.1.2檢驗水源水時，如污染較嚴重，應加大稀釋度，可接種1，0.，0.101ml甚至0.1,0.01,0.001mL,每個稀釋度接種5管，每個水樣共接種15管。接種1mL以下水樣時，必須作10倍遞增稀釋后，取1mL接種，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌刻度吸管。
2.1.5.1.3將接種管置36℃±1℃培養箱內，培養24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培養管胨不產氣酸，則可報告為總大腸菌群陰性，如有產酸產氣者，則按下列步驟進行。
2.1.5.2分離培養
將產酸產氣的發酵管分別轉鐘在伊紅美藍瓊脂平板上，于36℃±1℃培養箱內培養18h-24h，觀察菌落形態，挑取符合下列特征的菌落作革蘭氏染色，鏡檢和證實試驗。
深紫黑色、具有金屬光澤的菌落；
紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；
淡紫紅色、中心較深的菌落。
2.1.5.3證實試驗
經上述染色鏡檢為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，同時接種乳糖蛋白胨培養液，置36℃±1℃培養箱中培養18h-24h，產酸產氣者，即證實有總大腸菌群存在。
2.1.6結果報告
根據證實為總大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100mL水樣中的總大腸菌群可能數值。5管法結果見表2,15管法結果見表3。稀釋樣品查表后所得結果應乘以稀釋倍數。如所有乳糖發酵管均陰性時，可報告總大腸菌群未檢出。
