水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定酶底物法
Water quality—Determination of total coliforms, fecal coliforms and Escherichia coli—Enzyme substrate method
生 態 環 境 部 發 布
前言
1 適用范圍
2規范性引用文件
3術語和定義
4方法原理
5干擾和消除
6試劑和材料
7儀器和設備
8 樣品
9分析步驟
10結果計算與表示
11精密度和準確度
12 質量控制
13廢棄物處理
附錄 A（資料性附錄）結果判定參考圖片
附錄 B（規范性附錄）97 孔定量盤法 MPN 表
附錄 C（資料性附錄）97 孔定量盤法 MPN 表對應 95%置信區間
前 言
為貫徹《中華人民共和國環境保護法》和《中華人民共和國水污染防治法》，保護生態
環境，保障人體健康，規范水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定方法，制定
本標準。
本標準規定了測定地表水、地下水、生活污水和工業廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。
本標準的附錄A為規范性附錄，附錄B和附錄C為資料性附錄。
本標準為次發布。
本標準由生態環境部生態環境監測司、法規與標準司組織制訂。
本標準起草單位：上海市環境監測中心。
本標準驗證單位江蘇省環境監測中心、浙江省環境監測中心、常州市環境監測中心、上海市松江區環境監測站、上海市長寧區環境監測站和上海市青浦區環境監測站。
本標準生態環境部2018年12月26日批準。
本標準自2019年6月1日起實施。
本標準由生態環境部解釋。
1水質總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定 酶底物法
1 適用范圍
本標準規定了測定水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的酶底物法。
本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業廢水中總大腸菌群、糞大腸菌群和大腸埃希氏菌的測定。
本方法的檢出限為 10 MPN/L。
2 規范性引用文件
本標準引用了下列文件或其中的條款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本適用于本標準。
GB/T 6682 分析實驗用水規格和實驗方法
GB/T 14581 水質 湖泊和水庫采樣技術指導
HJ 494 水質 采樣技術指導
HJ/T 91 地表水和污水監測技術規范
3 術語和定義
下列術語和定義適用于本標準。
3.1
總大腸菌群 total coliforms37℃培養 24 h，能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。
3.2
糞大腸菌群 fecal coliforms又稱耐熱大腸菌群（thermotolerant coliforms）。44.5℃培養 24 h，能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基苯酚的腸桿菌科細菌。
3.3
大腸埃希氏菌 Escherichia coli俗稱大腸桿菌。37℃培養 24 h，能產生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase），分解選擇性培養基中的鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黃色的鄰硝基苯酚，同時產生β-葡萄糖醛酸酶（β-Glucuronidase），分解選擇性培養基中的 4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷2（MUG）釋放出熒光物質（4-甲基傘形酮）的腸桿菌科細菌。
3.4
大可能數 most probable number（MPN）又稱稀釋培養計數，是一種基于泊松分布的間接計數法。利用統計學原理，根據一定體積不同稀釋度樣品經培養后產生的目標微生物陽性數，查表估算一定體積樣品中目標微生物存在的數量（單位體積存在目標微生物的大可能數）。
4 方法原理
在特定溫度下培養特定的時間，總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌能產生β-半乳糖苷酶，將選擇性培養基中的無色底物鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）分解為黃色的鄰硝基苯酚（ONP）；大腸埃希氏菌同時又能產生β-葡萄糖醛酸酶，將選擇性培養基中的 4- 甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）分解為 4-甲基傘形酮，在紫外燈照射下產生熒光。
統計陽性反應出現數量，查 MPN 表，分別計算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群、大腸埃希氏菌的濃度值。
5 干擾和消除
5.1 活性氯具有氧化性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）
時加入硫代硫酸鈉溶液（6.4）消除干擾。
5.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內的酶活性，導致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5）消除干擾。
6 試劑和材料
除非另有說明，分析時均使用符合國家標準的分析純試劑，實驗用水應滿足 GB/T 6682中三級水的要求。
6.1 培養基。
本標準采用 Minimal Medium ONPG-MUG 培養基。每 100 ml 樣品需使用培養基粉末
2.7 g±0.5 g，所含基本成分如下：
硫酸銨[(NH4)2SO4] 0.5 g
硫酸錳（MnSO4） 0.05 mg
硫酸鋅（ZnSO4） 0.05 mg
硫酸鎂（MgSO4） 10 mg
氯化鈉（NaCl） 1 g
氯化鈣（CaCl2） 5 mg
亞硫酸鈉（Na2SO3） 4 mg
兩性霉素 B（Amphotericin B） 0.1 mg
鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG） 50 mg
4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG） 7.5 mg
茄屬植物萃取物（Solanium 萃取物） 50 mg
N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸鈉鹽（HEPES 鈉鹽） 0.53 g
N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸（HEPES） 0.69 g
也可采用市售商品化培養基制品。
6.2 硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。
6.3 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
6.4 硫代硫酸鈉溶液：ρ（Na2S2O3）=0.10 g/ml。
稱取 15.7 g 硫代硫酸鈉（6.2），溶于適量水中，定容至 100 ml，臨用現配。
6.5 乙二胺四乙酸二鈉溶液：ρ（C10H14N2O8Na2·2H2O）=0.15 g/ml。
稱取 15 g 乙二胺四乙酸二鈉（6.3），溶于適量水中，定容至 100 ml，此溶液保質期為30 d。
6.6 97 孔定量盤：含 49 個大孔，48 個小孔。其中，每個小孔可容納 0.186 ml 樣品，大孔中 48 個大孔每個可容納 1.86 ml 樣品，一個頂部大孔可容納 11 ml 樣品。也可采用經環氧乙烷滅菌的市售商品化成品。
6.7 標準陽性比色盤。
6.8 無菌水：取適量實驗用水，經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，備用。
7 儀器和設備
7.1 采樣瓶：具螺旋帽或磨口塞的 100 ml、250 ml、500 ml 廣口玻璃瓶。
注：在采集不存在或不考慮余氧、金屬離子干擾的樣品時，可采用市售無菌采樣瓶或無菌采樣袋。
7.2 高壓蒸汽滅菌器：121℃可調。
7.3 恒溫培養箱：允許溫度偏差 37℃±1℃、44.5℃±0.5℃。
7.4
程控定量封口機：用于 97 孔定量盤（6.6）的封口。
7.5 紫外燈：365～366 nm。
7.6 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可采用計量合格的可調式移液器。
7.7 三角瓶：100 ml。
7.8 量筒：100 ml±1 ml。
7.9 一般實驗室常用儀器和設備。
注：三角瓶、移液管、采樣瓶等玻璃器皿及采樣器具要在試驗前按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min，烘干，備用。
8 樣品
8.1 樣品采集
點位布設及采樣頻次按照 GB/T 14581、HJ/T 494 和 HJ/T 91 的相關規定執行。
采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。
采集河流、湖庫等地表水樣品時，可握住瓶子下部直接將帶塞采樣瓶插入水中，約距水面 10～15 cm 處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水中取出。如果沒有水流，可握住瓶子水平往前推。采樣量一般為采樣瓶容量的 80%左右。樣品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。
從龍頭裝置采集樣品時，不要選用漏水龍頭，采水前將龍頭打開至大，放水 3～5 min，然后將龍頭關閉，用火焰灼燒約 3 min 滅菌或用 70%～75%的酒精對龍頭進行消毒，開足龍頭，再放水 1 min，以充分除去水管中的滯留雜質。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內。
采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。
在同一采樣點進行分層采樣時，應自上而下進行，以免不同層次的攪擾。
如果采集的是含有活性氯的樣品，需在采樣瓶滅菌前加入硫代硫酸鈉溶液（6.4），以除去活性氯對細菌的抑制作用（每 125 ml 容積加入 0.1 ml 的硫代硫酸鈉溶液）；如果采集的是重金屬離子含量較高的樣品，則在采樣瓶滅菌前加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.5），以消除干擾（每 125 ml 容積加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二鈉溶液）。
注：15.7 mg 硫代硫酸鈉（6.2）可去除樣品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據樣品實際活性氯量調整。
8.2 樣品保存
采樣后應在 2 h 內檢測，否則，應 10℃以下冷藏但不得超過 6 h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于 4℃以下冷藏并在 2 h 內檢測。
9 分析步驟
9.1 樣品稀釋
根據樣品污染程度確定接種量（見表 1），避免接種樣品培養后 97 孔定量盤（6.6）出現全部陽性或全部陰性。接種量小于 100 ml 時，應稀釋樣品后接種，接種量為 10 ml 時，
取 10 ml 樣品加入到盛有 90 ml 無菌水（6.8）的三角瓶（7.7）中混勻制成 1:10 的稀釋樣品，其他接種量的稀釋樣品依次類推。對于未知樣品，可選用多個接種量進行檢測。
表 1 樣品接種量參考表
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樣品類型 |
接種量（ml）
|
102
|
10
|
1 |
0.1 |
10–2 |
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地表水 |
水源水 |
▲ |
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湖泊（水庫） |
▲ |
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河流 |
▲ |
▲ |
▲ |
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廢水 |
生活污水 |
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▲ |
▲ |
▲ |
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工業廢水 |
處理前 |
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▲ |
▲ |
▲ |
▲ |
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處理后 |
▲ |
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地下水 |
▲ |
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9.2 接種
量取 100 ml 樣品或稀釋樣品于滅菌后的三角瓶，加入 2.7 g±0.5 g 培養基（6.1）粉末，充分混勻，完全溶解后，全部倒入 97 孔定量盤（6.6）內，以手撫平 97 孔定量盤背面，趕除孔內氣泡，然后用程控定量封口機（7.4）封口。觀察 97 孔定量盤顏色，若出現類似或深于標準陽性比色盤（6.7）的顏色，則需排查樣品、培養基、無菌水等一系列因素后，終止試驗或重新操作。
注：9.1、9.2 步驟在野外操作時應避開明顯局部污染源，建議使用手套、口罩、酒精燈等。
9.3 培養
測定總大腸菌群和大腸埃希氏菌時，將封口后的 97 孔定量盤放入恒溫培養箱（7.3）中37℃±1℃下培養 24 h。
測定糞大腸菌群時，將封口后的 97 孔定量盤放入的恒溫培養箱中 44.5℃±0.5℃下培養24 h。
9.4 對照試驗
9.4.1 空白對照
每次試驗都要用無菌水（6.8）按照步驟 9.1～9.3 進行實驗室空白測定。培養后的 97 孔定量盤不得有任何顏色反應，否則，該次樣品測定結果無效，應查明原因后重新測定。
9.4.2 陰性和陽性對照
總大腸菌群、大腸埃希氏菌、糞大腸菌群的陰性、陽性菌株參考表 2。
表 2 陰性、陽性菌株參考表
|
檢測指標 |
陽性菌種 |
陰性菌種 |
總大腸菌群
|
大腸埃希氏菌、
產氣腸桿菌（Enterobacter aerogenes） |
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、
假單胞菌屬（Pseudomonas sp.） |
大腸埃希氏菌
|
大腸埃希氏菌
|
金黃色葡萄球菌、
假單胞菌屬 |
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糞大腸菌群 |
大腸埃希氏菌（耐熱型）、
克雷伯氏菌屬（Klebsiella trevisan）（耐熱型） |
產氣腸桿菌、
糞鏈球菌（Streptococcus faecalis）、
假單胞菌屬 |
將標準菌株制成 300～3000 個/ml 的菌懸液，將菌懸液按接種（9.2）和培養（9.3）要求
操作，陽性菌株應呈現陽性反應；陰性菌株呈現陰性反應，否則，該次樣品測定結果無效，應重新測定。
注：可先制備較高濃度菌懸液，采用血球計數器在顯微鏡下對其濃度進行初步測定，然后根據實際情況用無菌水（6.8）稀釋至 300～3000 個/ml。
9.4.3 結果判讀與計數
將培養 24 h 后的 97 孔定量盤進行結果判讀，樣品變黃色判斷為總大腸菌群或糞大腸菌群陽性；樣品變黃色且在紫外燈（7.5）照射下有藍色熒光，判斷為大腸埃希氏菌陽性。如果結果可疑，可延長培養至 28 h 進行結果判讀，超過 28 h 后出現的顏色反應不作為陽性結果。可使用保質期內的標準陽性比色盤以輔助判讀，參見附錄 A。
分別記錄 97 孔定量盤中大孔和小孔的陽性孔數量。
10 結果計算與表示
10.1 結果計算
從 97 孔定量盤法 MPN 表（見附錄 B）中查得每 100 ml 樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌的 MPN 值（置信區間參見附錄 C）后，再根據樣品不同的稀釋度，按照公式（1）換算樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌濃度（MPN/L）：
C=MPN值×1000/f（1）
式中：C——樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌濃度，MPN/L；
MPN 值——每 100 ml 樣品中總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌濃度，
MPN/100 ml；
1000——將 C 單位由 MPN/ ml 轉換為 MPN/L；
f ——大接種量，ml。
10.2 結果表示
測定結果保留兩位有效數字，當測定結果≥100 MPN/L 時，以科學計數法表示；若 97
孔均為陰性，可報告為總大腸菌群、糞大腸菌群數或大腸埃希氏菌未檢出或＜10 MPN/L。
11 精密度和準確度
11.1 精密度
6 個實驗室分別對低濃度（地下水，濃度均值為 6.0×10
2 MPN/L）、中濃度（地表水，
濃度均值為 4.0×10
4 MPN/L）和高濃度（生活污水，濃度均值為 9.0×107 MPN/L）三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品（濃度為 2000 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.26%～1.3%、0.65%～2.0%、1.3%～3.7%和 0.68%～2.8%；實驗室間相對標準偏差分別為 9.9%、1.3%、4.2%和 1.3%；重復性限為 0.17、0.18、0.21 和 0.18；再現性限為 1.8、0.23、0.38 和 0.20；實驗室間置信區間見表 3。
表 3 總大腸菌群實驗室間 95%置信區間表
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低濃度（MPN/L） |
中濃度（MPN/L） |
高濃度（MPN/L） |
有證標準樣品 |
|
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
6.4×102
|
5.5×102～7.4×10 |
4.0×104 |
3.5×104～4.6×104 |
4.1×106 |
3.7×106～4.6×106 |
1.4×103 |
1.8×10
3～2.3×103 |
3 6 個實驗室分別對低濃度（地下水，濃度均值為 70 MPN/L）、中濃度（地表水，濃度均值為 9.0×10
3 MPN/L）和高濃度（生活污水，濃度均值為 2.0×10
6 MPN/L）三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品（濃度為 2000 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.69%～1.9%、0.93%～2.9%、5.4%～21%和 1.8%～3.0%；實驗室間相對標準偏差分別為 9.6%、1.6%、15%和 3.7%；重復性限為 0.23、0.21、0.58 和 0.19；再現性限為 1.7、0.26、0.90 和 0.35；實驗室間置信區間見表 4。
表 4 大腸埃希氏菌實驗室間置信區間表
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低濃度（MPN/L） |
中濃度（MPN/L） |
高濃度（MPN/L） |
有證標準樣品 |
|
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
|
59 |
39～90 |
8.5×103 |
7.3×103～9.9×103 |
1.5×106 |
1.3×106～1.7×106 |
7.7×102 |
1.7×103～2.3×103 |
3 6 個實驗室分別對低濃度（地下水，濃度均值為 1.0×10
2 MPN/L）、中濃度（地表水，濃度均值為 1.3×10
4 MPN/L）和高濃度（生活污水，濃度均值為 3.0×10
6 MPN/L）三個不同濃度細菌總數的樣品及有證標準樣品（濃度為 3700 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內相對標準偏差范圍分別為 0.40%～2.4%、1.3%～2.9%、3.4%～17%和 2.4%～9.2%；實驗室間相對標準偏差分別為 8.9%、6.4%、6.6%、6.4%；重復性限為 0.22、0.26、0.58 和 0.55；再現性限為 1.6、0.76、0.64 和 0.75；實驗室間置信區間見表 5。
表 5 糞大腸菌群實驗室間置信區間表
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低濃度（MPN/L） |
中濃度（MPN/L） |
高濃度（MPN/L） |
有證標準樣品 |
|
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
均值 |
95%置信區間 |
|
92 |
62～1.3×102 |
1.1×
104 |
9.5×103～1.4
×104 |
1.8×106 |
1.6×106～2.1×106 |
1.4×102 |
2.5×103～5.4×103 |
6 家實驗室對總大腸菌群有證標準樣品（2000 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-6.4%～-3.5%；相對誤差的值為-4.7%±1.2%。
6 家實驗室對大腸埃希氏菌群標準樣品（2000 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-15%～-6.3%；相對誤差的值為-13%±3.3%。
6 家實驗室對糞大腸菌群的有證標準樣品（3700 MPN/L）進行了 6 次重復測定：實驗室內的相對誤差范圍為-17%～-0.81%；相對誤差的值為-13%±6.1%。
注：微生物檢測數據為偏態分布，其測定結果全部經以 10 為底對數轉換后進行計算。
12 質量控制
12.1 每批樣品按對照試驗（9.4）進行空白對照測定，定期使用有證標準菌株進行陽性和
陰性對照試驗。
12.2 每 20 個樣品或每批次樣品（≤20 個/批）測定一個平行雙樣。
12.3 對每批次培養基須使用有證標準菌株進行培養基質量檢驗。
12.4 定期使用有證標準菌株/標準樣品進行質量控制。
13 廢物處理
實驗中產生的廢物經 121℃高壓蒸汽滅菌 20 min 后，作為一般廢物處理。
