固定底物技術酶底物發檢測上海地表水中腸球菌
摘 要：
將固定底物技術酶底物法應用于檢測地表水中腸球茵的含量，并對上海7個樣點的地表水進行檢測。結果表明，黃浦江水從上游至下游 5個樣 點腸球菌平均含量分別為 66．4，166．2，302．6，1436．5和 3899．0MPN／100 mL，長江水 2個樣點為 12．0和 4．1MPN／100mL，黃浦江水腸球菌含量遠高于長江水，所得結果均符合要求，能夠用于地表水的檢測。
在細菌學分類上，腸球菌(Enterococcu)屬原歸屬于鏈球菌屬。1989年，依據 Facklam和 Colins的分類，劃分出腸球菌，該屬共有 12個種和 1個變異株 ，包括寄生于人類、牛及其他動物的糞腸球菌以及寄生于人類、牛及其他動物、家禽和豬中的屎腸球菌等。
腸球菌通常寄生于各種溫血和冷血動物的腔腸，也是健康人體的上呼吸道、口腔或腸道的常居菌，其在宿主組織寄生，導致宿主非特異及免疫防御機制紊亂，并引起病理改變，能導致感染，可以引起宿主心內膜炎、膽囊炎、腦膜炎、尿路感染及傷口感染等多種疾病。此屬細 菌極易污染食品以及生活和加工用水，易傳播疾病。此外，腸球菌具有天然耐藥和獲得性耐藥的特征，故會使所致感染治療困難。因此 ，腸球菌成為食品、水質、加工設備衛生和生產環境衛生狀況的評估指標。
腸球菌可用作糞便污染的指示。多數菌種不能在水中繁殖，而人糞便中的腸球菌數量比大腸菌群低一個數量級。該菌群的重要特點是在水中存活的時間比大腸桿菌(或耐熱大腸桿菌)長，對干燥和氯的抵抗力更強。腸球菌已被用于檢測原水中存活時間比大腸桿菌長的糞源致病菌以及飲用水中對大腸桿菌的增強檢測。此外，它們還用于輸配水系統維修后或新管線鋪設后的水質檢測。現已將其列入《生活飲用水衛生標準》。
衛生學家認為，腸球菌對惡劣的外環境和冷凍條件具有較強的抵抗力，因此將其作為監測水質、環境衛生質量的污染指標更具有衛生學意義。鑒于腸球菌對人體的危害程度，加強原水中腸球菌的檢測有一定的意義，甚至在今后條件允許的情況下，在水廠出廠水以及管網水的檢測中增加對腸球菌的監測，能進一步保障城市居民用水的安全性。
1 材料和方法
1．1 材料
1．1．1 儀器
立科封口機；恒溫培養箱：(41±0．5)℃；紫外光燈：6W，365nm；無菌取樣瓶：100mL。
1．1．2 培養基及耗材
培養基測試包；檢測耗材97孔定量盤套裝。
1．2 方法
1．2．1 方法原理
腸球菌固定底物技術酶底物法 (DefinedSubstrateTechnology，DST)是指在選擇性培養基上能產生 p一葡萄糖苷酶 (p—glucosidase)的革蘭氏陽性菌，該菌群能分解熒光底物 p—D一配光的則為腸球菌陰性。根據計數的陽性格子數對照 MPN表得到定量檢測結果。
2 結果和分析
2．1 準確度計算及檢測方法質量控制
通過購買腸球菌質控標樣，采用上述方法進行檢測，結果如表1所示。
表 1 質控標樣檢測結果
(MPN·10
-2 mL
-1 )一
|
項目 |
腸球菌（陽性標樣） |
大腸桿菌（陰性標樣） |
牛鏈球菌（陰性標樣） |
|
平行 |
59.4 |
0 |
0 |
|
平行 |
45.5 |
0 |
0 |
|
平均值 |
52.5 |
0 |
0 |
質控標樣證書給出的真值為 56MPN／100mL，置信區間為23—85MPN／100mL。所得檢測結果的平均值在置信區間范圍內，符合要求，并且與真值的糖物(B D—glucoside)，釋放出熒光產物 4一甲基一傘形酮(4一methyl—unbeliferone)，使菌落能夠在紫外光條件下產生特征性熒光。
1．2．2 樣品的采集及處理
檢測水樣來自黃浦江的 5個地表水水樣 (從上游至下游分別編號為 H1、H2、H3、H4和 H5)，以及長江的2個地表水水樣 (分別編號為 C1和 C2)。采樣頻率為每月 1次 ，連續 3個月 。
1．2．3 試驗步驟
① 將 100mL水樣倒入無菌取樣瓶中。
② 將一份 EnterolertTM測試包試劑倒人裝有100mL水樣的無菌取樣瓶中。蓋上蓋子，搖勻，至完全溶解。
③ 將瓶內的水樣全部倒人97孔定量盤中，使用定量封口機進行封口。
④ 將封口完畢的定量盤放在 (41±0．5)℃培養箱中，培養24h。
⑤ 培養 24 h后，取出定量盤，在暗室中使用6W、365 nm的紫外燈在距樣品15em的位置處觀測其是否顯示藍色熒光。結果顯示為藍色螢光的為腸球菌陽性，無螢相對偏差為 6．67％ ，在可接受范圍內。
2．2 精密度和不確定度計算
抽選 H1水樣 ，對其進行 10組平行樣檢測 ，結果如表 2所示。
表 2 I-tl水樣平行樣檢測結果
|
項目 |
腸球菌／(MPN·10-2 mL-1 ) |
平均值 |
|
X1 |
X2 |
X3 |
X4 |
X5 |
X6 |
X7 |
X8 |
X9 |
X10 |
|
結果 |
39．3 |
39．9 |
65．0 |
63．1 |
46．5 |
51．2 |
34．1 |
49．6 |
61．3 |
62．4 |
51．2
|
|
LgX |
1．594 |
1．601 |
1．813 |
1．800 |
1．667 |
1．709 |
1．533 |
1．695 |
1．787 |
1．795 |
1．700
|
表 3 不同地表水結果對比 (MPN·10
-2 mL
-1 )
|
項目 |
水樣編號 |
一次結果 |
第二次結果 |
第三次結果 |
平均值 |
|
黃浦江水 |
H1 |
73.3 |
60.9 |
65.0 |
66.4 |
|
H2 |
204.6 |
160.7 |
133.3 |
166.2 |
|
H3 |
261.3 |
410.6 |
235.9 |
302.6 |
|
H4 |
1203.3 |
1 119.9 |
1986.3 |
1436.5 |
|
H5 |
1 553.1 |
1 299.7 |
1046.2 |
3 899.0 |
|
長江水 |
C1 |
13.4 |
11.9 |
10.8 |
12.0 |
|
C2 |
3.0 |
5.2 |
4.1 |
4.1 |
結論
對7個點的地表水水樣進行了腸球菌的檢測，共計采集35次水樣。其中包含5個黃浦江水樣點和2個長江水樣點。通過多次試驗，分別對該方法的準確度、精密度、不確定度進行計算，得出以下結論。
1、質控樣的檢測結果與真值之間的相對偏差微6.67%，在可接受范圍內。
2、隨機抽取H1點水樣，進行10組平行測定，得出相對標準偏差為5.9%，標準不確定度為0.032，兩者都相對較小。
3、黃浦江水比長江水中所含的長球菌數量要高，主要是由于黃浦江上游農業、畜牧業相對較多，水體受污染較嚴重。
