一、實驗目的和內容
目的：學習檢測水中大腸菌群的方法，了解大腸菌群數量與水質狀況的關系。
內容：1.用濾膜法檢測大腸菌群。
2.用多管發酵法檢測大腸菌群。
二、實驗材料和用具
復紅亞硫酸鈉培養基（遠藤氏培養基）、乳糖蛋白胨半固體培養基、乳糖蛋白胨培養液、三倍濃乳糖蛋白胨培養液、伊紅美藍培養基（EMB 培養基）。
微孔濾膜（孔徑0.45?m）、濾器（容量500mL）、抽氣設備、鑷子、發酵用試管、杜氏小管、培養皿、刻度吸管或移液管、接種環、酒精燈。
三、操作步驟
（一）水樣的采集
1.自來水 將自來水龍頭用火焰燒灼3min滅菌，再擰開水龍頭流水5min， 以排除管道內積存的死水，隨后用已滅菌的三角瓶接取水樣，以供檢測。
2.池水、河水或湖水 將無菌的帶玻塞的小口瓶浸入距水面10～15cm深的水層中，瓶口朝上，除去瓶塞，待水流入瓶中裝滿后，蓋好瓶塞，取出后立即進行檢測，或臨時存于冰箱，但不能超過24h。
（二）濾膜法檢測大腸菌群
l.用無菌鑷子將一無菌濾膜置于濾器的承受器當中，將過濾杯裝于濾膜承受器上，旋緊，使接口處能密封，將真空泵與濾器下部的抽氣口連接（圖26-1）。
2.加水樣100mL于濾杯中，啟動抽真空系統，使水通過濾膜流到下部，水中的菌細胞被截留在濾膜上。水樣用量可適當增減使獲得菌落適量。
3.用無菌鑷子小心將截留有細菌的濾膜取出，平移貼于復紅亞硫酸鈉固體培養基上（注意無菌操作，濾膜與培養基間貼緊，無氣泡），37℃培養16～l8h。挑選深紅色或紫紅色、帶有或不帶金屬光澤的菌落，或淡紅色、中心色較深的菌落進行涂片和革蘭氏染色觀察。
4.經染色證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌者，再接種在乳糖蛋白胨半固體培養基上，37℃培養6～8h后觀察，產氣者證實為大腸菌群陽性。培養中應及時觀察，時間過長則氣泡可能消失。
5.結果計算
水樣中總大腸菌群數/個？L-1=（濾膜生長的菌落數/過濾水樣量/mL）×100
（濾膜上菌落數以20～60個/片較為適宜）
（三）多管發酵法檢測大腸菌群
1.取5支裝有3倍濃乳糖蛋白胨培養基的初發酵管，每管分別加入水樣10mL。另取5支裝有乳糖蛋白胨培養基的初發酵管，每管分別加入水樣lmL。再取5支裝有乳糖蛋白胨培養基的初發酵管，每管分別加入按1：10稀釋的水樣lmL（即相當于原水樣0.1mL），均貼好標簽。此即為15管法，接種待測水樣量共計55.5mL。各管搖勻后在37℃恒溫箱中培養24h。
若待測水樣污染嚴重，可按上述3種梯度將水樣稀釋10倍（即分別接種原水樣1mL、0.lmL、0.01mL）、甚至100倍（即分別接種原水樣0.lmL、0.01mL、0.001mL），以提高檢測的準確度。此時，不必用3倍濃乳糖蛋白胨培養基，全用乳糖蛋白胨培養基。
2.取出培養后的發酵管，觀察管內發酵液顏色變為黃色者記錄為產酸，杜氏小管內有氣泡者記錄為產氣。將產酸產氣和只產酸的兩類發酵管分別劃線接種于伊紅美藍培養基上，在37℃恒溫箱中培養18～24h。挑選深紫黑色和紫黑色帶有或不帶有金屬光澤的菌落、或淡紫紅色和中心色較深的菌落，將其一部分分別取樣進行涂片和革蘭氏染色觀察。
3.經鏡檢證實為革蘭氏陰性無芽孢桿菌，則將此菌落的另一部分接種于裝有倒置杜氏小管的乳糖蛋白胨培養液的復發酵管中，每管可接種同一發酵管的典型菌落1～3個，37℃培養24h若為產酸產氣者表明試管內有大腸菌群菌存在，記錄為陽性管。
4.根據3個梯度（10mL、1ml、0.1mL）每5支管中出現的陽性管教（即為數量指標），查附注的“15管發酵法水中大腸菌群5次重復測數統計表”（表26-2）的細菌最可能數，再乘以100即換算成1升水樣中的總大腸菌群數。
四、注意事項
認真配制不同類型培養基。
檢測中應合理控制所加的水樣量。
在濾膜法中每片濾膜的菌落數以20～60個為宜。多管發酵法中水樣稀釋比例要適宜。
挑選菌落時認真選擇大腸菌群典型菌落。
五、演示
1.具有大腸菌群的發酵管中產酸與產氣特征的觀察。
2.在復紅亞硫酸鈉培養基和伊紅美藍培養基上大腸菌群典型菌落的色澤及特征的識別。
六、實驗報告
（一）實驗結果記錄
1.微孔濾膜法
過濾水樣量（mL）： ，37℃培養后特征菌落數： ，接種乳糖培養基后的陽性管數： 。
總大腸菌群數（個/L）： 。
2.多管發酵法檢測結果
（1）根據實驗數據查表26—2：
（2）多管發酵法結果填于下表中：（3）多管發酵法檢測結果：查表結果及總大腸菌群數（個/L）
